L'ADN est constitué deux brins enroulés en hélice et reliés entre eux par l'association de deux molécules distinctes qui forment "les marches" d'un immense escalier. Ces marches sont constituées à partir de 4 molécules appelées nucléotides : A pour adénine, T pour Thymine, C pour Cytosine et G pour guanine. Toutefois, A ne s'associe qu'avec T et G avec C. Leur agencement suivant un ordre et des séquences variables constitue notre patrimoine génétique.

Les puces à ADN tirent partie de la structure particulière de l'ADN. Formé de deux brins symétriques, un peu comme deux moitiés d'une fermeture éclair, chaque maillon ne peut se lier qu'avec le maillon qui lui est complémentaire. Par simple chauffage, il est possible de séparer les deux brins de la molécule d'ADN. Lorsque l'on refroidit lentement l'échantillon, les brins d'ADN complémentaires se reconnaissent et s'associent spontanément. Les puces à ADN exploitent ce phénomène d'hydridation à grande échelle.